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研究背景

结直肠癌（CRC）的发展是通过多种获得性遗传和表观遗传改变的积累，包括DNA甲基化、组蛋白乙酰化和组蛋白甲基化等，诱导正常结肠上皮向腺癌的恶性转化。在过去的几十年里，研究人员做了大量的工作来了解肿瘤细胞携带关键基因突变是如何影响其恶性细胞行为的。然而，是否存在突变的肿瘤细胞触发周围正常细胞恶性转化的可能性，目前尚不清楚。

肿瘤的发生和发展需要癌细胞的代谢重编程。揭示基因突变与代谢表型之间的相互作用无疑在理解癌症发病机制和发现新的治疗靶点中起着重要作用。关键基因突变总是导致代谢产物合成异常，包括天冬酰胺、α-酮戊二酸和谷氨酰胺。有证据表明，代谢物调节了氧化还原平衡、免疫微环境、肠道微生态和转移前生态位形成以支持肿瘤生长。然而，突变的肿瘤细胞来源的代谢物对正常细胞恶性转化的贡献尚不清楚。

在所有人类癌症中，PIK3CA是常发生突变的癌基因之一，使其成为癌症治疗的主要靶点阿培利司是一种选择性PIK3CA抑制剂，已被批准用于治疗携带PIK3CA突变的乳腺癌患者团队之前的工作表明，与野生型肿瘤相比，阿培利司在PIK3CA突变异种移植肿瘤中表现出更好的肿瘤抑制作用。然而，早期临床试验结果显示在治疗携带PIK3CA突变的结肠癌中阿培利司响应并不令人满意。鉴于阿培利司选择性靶向PIK3CA突变的肿瘤细胞，这意味着仅靶向突变的肿瘤细胞可能不足以治疗结肠癌。

昊客户文章

2024年4月5日，济宁医学院附属医院医学研究中心张斌团队联合济宁医学院免疫学与分子医学研究所熊化保团队在Cell子刊Cell Reports Medicine（中科院1区，IF：14.3）上在线发表新研究成果“Arachidonic acid released by PIK3CA mutant tumor cells triggers malignant transformation of colonic epithelium by inducing chromatin remodeling”，揭示了“PIK3CA突变肿瘤细胞释放花生四烯酸（AA），通过诱导染色质重塑引发结肠上皮的恶性转化”。据悉，济宁医学院附属医院医学研究中心何宝玉和别庆丽为论文的共同一作。

在该研究中，研究团队发现PIK3CA突变肿瘤细胞将外泌体AA传递给肠上皮细胞（IECs）并触发H3K4三甲基化，导致IECs恶性转化。这一过程在IECs向肿瘤细胞的进化中起着重要作用。因此，当前的研究结果定义了突变肿瘤细胞的生物学特性以及突变肿瘤细胞与IECs恶性转化之间的因果关系，突出了阻断PIK3CA突变细胞向相互作用的IECs的恶性信号传递途径的鼓舞人心的前景，从而为肿瘤患者的靶向治疗开辟了新的领域。

值得一提的是，6163银河线路检测中心生物在本次研究中协助团队承担了ATAC-seq、RNA-seq、WGS拷贝数检测、DNA甲基化等多组学实验和分析工作。让我们一探论文成果吧！

主要研究结果

1.PIK3CA突变肿瘤细胞将肠上皮细胞恶性转化为肿瘤细胞，促进结直肠癌的进展

目前尚不清楚PIK3CA突变的肿瘤细胞如何影响周围的正常细胞。为此，研究团队设计了如图1A所示的直接驯化模型。结果表明，由PIK3CA E545K肿瘤细胞和NCM460细胞混合形成的异种移植瘤比由PIK3CA野生型（WT）肿瘤细胞和NCM460细胞混合形成的异种移植瘤以及纯PIK3CA E545K或WT肿瘤细胞组发生率更高，肿瘤生长速度更强（详见原文补充材料）。

然后，研究团队在体内和体外评估了驯化后的NCM460 F2代细胞的生物学功能。观察到，PIK3CA E545K肿瘤细胞驯化的NCM460细胞与纯PIK3CA WT肿瘤细胞（GFP+ DLD1WT细胞）的异种移植瘤分离的细胞相比具有相当的肿瘤形成能力（图1B）和转移潜力（图1C，1D）。有趣的是，PIK3CA WT肿瘤细胞驯化的NCM460细胞未能显示出肿瘤形成能力和转移表型（图1B-1D）。

接下来，团队着手确定IECs中PIK3CA突变肿瘤细胞的转化是否依赖于直接的物理接触。如图1E所示，研究人员采用了远端驯化模型，由三组组成。观察显示PIK3CA突变肿瘤细胞可以远程诱导非致瘤性NCM460细胞形成可见的肿瘤，而PIK3CA WT细胞缺乏这种能力（图1F）。此外，PIK3CA突变肿瘤细胞远程驯化的NCM460细胞与PIK3CA WT肿瘤细胞表现出相当的致瘤性，这可以从几乎相同的肿瘤发生率和肿瘤生长曲线中得到证明（图1G）。

PIK3CA突变肿瘤细胞的成功诱导使研究人员推测这些细胞可能通过旁分泌机制将恶性信号传递给周围细胞。正如预期的那样，NCM460细胞和PIK3CA WT肿瘤细胞用从PIK3CA突变癌症供体细胞来源的条件培养基处理后显示出增强的体外功能（详见原文补充材料）。氧化偶氮甲烷/右旋糖酐硫酸酯钠（AOM/DSS）诱导的结直肠肿瘤发生模型进一步支持了这一观察结果（图1H）。用PIK3CA E545K肿瘤细胞的条件培养基处理可显著促进AOM/DSS诱导的结直肠肿瘤发生，结肠组织学、肿瘤数量和小鼠存活率均可证明这一点（图1I-1K）。综上所述，这些发现表明PIK3CA突变肿瘤细胞通过旁分泌机制传递恶性信号并启动IECs的恶性转化。

图1  动物模型实验表明PIK3CA突变细胞可引发结肠上皮细胞的恶性转化

2.外泌体成分是承担致癌突变信号传递的关键介质

细胞培养上清中的旁分泌成分主要由可溶性细胞因子和细胞外囊泡（EVs）组成，其中外泌体是EVs的主要类型。初，研究人员分离并验证了来自PIK3CA突变肿瘤细胞和WT肿瘤细胞的外泌体。有趣的是，来自PIK3CA突变肿瘤细胞的外泌体成分和条件培养基在提高NCM460受体细胞的细胞活力方面表现出相当的效率；当耗尽外泌体时，条件培养基的诱导能力被完全消除，支持外泌体成分负责PIK3CA突变肿瘤细胞恶性信号传递的可能性。

为了进一步证实这一观点，研究人员进行了体内实验（图2A）。一致地，来自PIK3CA突变肿瘤细胞的条件培养基和外泌体成分在NCM460受体细胞中诱导了致瘤表型，可见肿瘤的形成证明了这一点（图2B和2C）。来自PIK3CA突变肿瘤细胞的条件培养基或外泌体成分显著加剧了AOM/DSS诱导的结直肠肿瘤发生（图2D-2H）。这些发现有力地验证了外泌体成分在PIK3CA突变相关的致癌信号传递中作为介质的关键作用。

图2 外泌体成分是传递基因突变信号的关键介质

3.外泌体介导的花生四烯酸作为传递PIK3CA突变信号的关键介质

代谢特征在决定细胞命运转变中起着至关重要的作用，并能显著影响细胞行为。鉴于在驯化的IECs中观察到的异常的致癌表型和致瘤性，研究人员提出隐藏在外泌体中的代谢物可能控制恶性信号的传递。为了探索这一假设，团队进行了一项非靶向代谢组学分析，以检查代谢物组成的差异。值得注意的是，与各自的对照相比，PIK3CA突变供体细胞、外泌体成分和NCM460受体细胞的差异代谢物中，AA是显著上调的代谢物（图3A和3B）。有趣的是，PIK3CA突变细胞和PIK3CA WT细胞的去外泌体培养基中AA水平差异极小（图3A，3B）。这些发现使研究人员推测PIK3CA突变细胞可能通过外泌体将AA转运到IECs，从而促进恶性信号的传递。

为了进一步证实这一假设，研究人员对五组AA进行了定量检测：（1）与PIK3CA WT肿瘤相比，PIK3CA突变肿瘤组织中的AA水平显著升高（图3C）；（2）CRC患者血清中AA水平明显高于健康对照组（图3D）；（3）携带PIK3CA突变异种移植肿瘤的小鼠血清显示AA水平升高（图3E）；（4）与直接驯化模型中外泌体缺失的对照组相比，血清外泌体成分显示出明显的AA水平升高（图3F）；（5）携带Pik3caH1047R/+突变的小鼠血清中AA水平升高（图3G）。因此，上述实验模型中AA的检测和比较一致地支持了AA可能在恶性信号传递中起关键中介作用的观点。

接下来，研究人员呈现了多个证据来验证AA在PIK3CA突变肿瘤细胞向IECs传递恶性信号中的关键作用：（1）AA显著增强了AOM/DSS诱导的结直肠肿瘤发生（图3H-3K）；（2）细胞质磷脂酶敲除（cPLA2 KO）的PIK3CA突变肿瘤细胞未能在NCM460细胞中远程诱导致瘤表型（图3L，3M）；（3）cPLA2 KO的PIK3CA突变肿瘤细胞的外泌体成分降低致瘤性（图3N-3Q）；总的来说，这些数据有力地支持了外泌体介导的AA是负责传递PIK3CA突变信号的关键介质的观点。

图3 外泌体介导的AA承担致癌突变信号的传递

4.PI3K-PDK1-SGK3轴通过促进FBW7 T680磷酸化来调节cPLA2蛋白的稳定性，从而促进AA的生物合成

接下来研究的目标是阐明PIK3CA突变细胞庇护升高AA的机制。结果观察到，cPLA2，AA的主要供给者，在PIK3CA突变存在下表现出显著增加的磷酸化和总蛋白水平，而编码cPLA2的基因PLA2G4A的表达保持不变（图4A）。有趣的是，cPLA2的磷酸化和总蛋白水平的变化存在差异。具体来说，与PIK3CA突变相关cPLA2总蛋白增加了7-8倍，而cPLA2磷酸化水平仅增加了3-4倍（图4A）。因此，推测PIK3CA突变可能主要参与cPLA2蛋白稳定性的调控。与这一假设一致，研究观察到在PIK3CA突变存在下，蛋白质稳定性显著增加，K48相关的cPLA2泛素化减弱（图4B，4C）。进一步实验发现FBW7在PIK3CA突变肿瘤细胞中表现出与cPLA2更弱的相互作用，FBW7的KO确实导致cPLA2泛素化降低，同时cPLA2总蛋白和AA水平升高（图4D和4E）。为了进一步证明FBW7是cPLA2的E3泛素连接酶，团队进行了体外泛素化实验，观察到FBW7可以直接泛素化cPLA2（图4F）。

此外，在PIK3CA突变体和WT肿瘤组织中，FBW7和cPLA2的表达模式和预后标志呈现相反的趋势（图4G）。进一步观察到FBW7和cPLA2蛋白水平在PIK3CA突变体和WT肿瘤组织中均呈显著负相关，其中在PIK3CA突变组中相关性更强（图4H）。

先前的报道表明FBW7的降解依赖于磷酸化。在PIK3CA突变的情况下，研究人员检测了FBW7的总丝氨酸（Ser）磷酸化和苏氨酸（Thr）磷酸化水平。有趣的是，两个热点的PIK3CA突变一致地增加FBW7的总Thr磷酸化水平，而不影响Ser磷酸化（图4I）。为了确定被PI3K活性磷酸化的FBW7的特定苏氨酸残基，在FBW7的不同苏氨酸磷酸化位点引入了突变。FBW7 T680A突变体几乎完全消除了FBW7的Thr磷酸化（图4J）。相比之下，其他FBW7突变蛋白（包括T205A、T692A和T695A）的Thr磷酸化与FBW7 WT蛋白相似（图4J）。此外，虽然激活PI3K活性未能增强FBW7 T680A突变体的Thr磷酸化，但它明显增加了FBW7其他三种突变体蛋白的Thr磷酸化，并增加了PI3K下游底物活性（图4K）。此外，与WT蛋白相比，FBW7 T680A突变体表现出更高的稳定性，这表明缺乏磷酸化的FBW7 T680A突变体的降解减少（图4L）。这些数据表明，致癌PIK3CA信号通过触发FBW7 Thr680位点的磷酸化特异性地破坏FBW7的稳定。

为了剖析连接活性PI3K和FBW7磷酸化的信号级联，研究人员在PIK3CA突变体和WT肿瘤细胞中寻找与FBW7相互作用差异的激酶。在潜在的FBW7结合蛋白中，多种激酶—SGK3、PGK1、STK39、CDK1和AURKB进行进一步验证。结果发现在PIK3CA突变肿瘤细胞中，SGK3的沉默明显减弱了FBW7的Thr磷酸化，同时FBW7蛋白水平升高，cPLA2蛋白水平和AA丰度降低（图4M，4N）。FBW7 T680磷酸化的减少发生在SGK3沉默时，而不是在沉默时其他几种激酶（图4M）。这一结果表明，SGK3是活性PI3Kα的关键下游信号分子，负责磷酸化FBW7的Thr680位点。PDK1/SGK3信号通路已被认为是AKT非依赖性PI3Kα致癌信号的下游效应器。PDK1的敲低导致FBW7磷酸化降低，FBW7蛋白水平升高，cPLA2蛋白和AA丰度降低，这一结果与SGK3沉默时的类似。

总结以上结果，当前模型建立了先前不相关成分之间的生物学联系，将PI3K信号和cPLA2稳态联系起来，从而增强了AA代谢（图4Q）。

图4 阐明PIK3CA突变调控cPLA2稳定性和AA生物合成的分子机制

5.AA通过H3K4me3影响染色质重塑

先前的研究表明AA可以调节结肠癌细胞中许多基因的表达；然而，其潜在机制在很大程度上仍不清楚。当前的RNA-seq数据表明，AA处理的NCM460细胞与对照相比1312个基因水平上调，741个基因水平下调（图5A和5B）。基因表达的广泛变化通常与染色质重塑密切相关。因此，继而使用转座酶可接近的染色质测序（ATAC-seq）方法研究了AA处理的NCM460细胞的染色质可及性状态。观察到，在AA处理的NCM460细胞中，与对照组相比，1812个基因的可及性增加，567个基因的可及性降低（图5C和5D）。

转录因子通过调控基因表达在肿瘤发展和恶性进展中发挥重要作用。通过联合RNA-seq和ATAC-seq数据，筛选到88个基因存在交集，其中8个肿瘤相关转录因子在AA处理后显示出表达上调及染色质区域的开放状态（图5E）。这一结果表明，AA可能通过调节IECs染色质重塑来诱导多种癌症相关转录因子的表达。

然后，团队研究了AA对组蛋白甲基化的影响。有趣的是，AA处理导致NCM460细胞中组蛋白H3K4三甲基化（H3K4me3）水平显著增加，而其他位点的组蛋白三甲基化，包括H3K4、H3K9、H3K36和H3K76没有受到影响（图5F）。接下来，染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）检测AA处理NCM460细胞启动子染色质状态中的H3K4me3修饰。对启动子区域的特异性分析显示，与对照组相比AA处理的NCM细胞中启动子相关的H3K4me3中有2589个基因增加，1275个基因减少（图5G）。这8种转录因子的基因区域显示，在AA处理的NCM460细胞中，启动子相关的H3K4me3水平升高（图5H）。此外，观察到H3K4me3抑制剂MM-102有效地破坏了在ATAC-seq数据中观察到的含有8个转录因子位点的可及性增强（图5I和5J）。总的来说，这些发现一致地证实了AA通过调节H3K4me3激活癌症相关的转录因子转录。

图5 AA通过H3K4me3影响染色质重塑

6.AA特异性结合到Menin蛋白并增强Menin-MLL1/2相互作用

代谢蛋白相互作用调节多种细胞过程，因此在维持细胞稳态中起着重要作用。然而，作为一种具有生物活性的脂质分子，AA潜在的相互作用蛋白尚不清楚。研究团队开发了一种通过整合免疫沉淀和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的方法来定量AA与亚基蛋白的痕量结合。有趣的是，结果观察到Menin免疫沉淀代谢物中AA丰度显著增加，与免疫球蛋白G（IgG）对照相比，抗Menin免疫沉淀中AA丰度约为31.2倍（图6A）。然而，在其他9个亚基的免疫沉淀中，AA的富集与相应的IgG对照相当（图6A）。此外，观察到，与抗Rbbp5、抗Wdr82、抗Cfp1、抗Wdr5和抗Ash2l相比，抗Menin免疫沉淀中AA的富集程度分别约为16.2倍、28.6倍、27.7倍、28.1倍和26.1倍（图6B）。数据表明，AA特异性结合Compass复合物的Menin调节亚基。

分子对接分析证实了这些观察结果，表明AA优先停靠在中央腔中，在Menin拇指结构域和手掌结构域形成的界面上（图6C，左），主要依赖于与Tyr323的氢键（图6C，右）。生物化学方面，体外结合实验表明纯化的Menin WT蛋白与AA之间存在直接相互作用，相反，Menin Y323A突变体消除了与AA的结合能力（图6D-6F）。更重要的是，研究观察到PIK3CA突变的肿瘤细胞能够远程诱导NCM460细胞的可见实体肿瘤，而Menin Y323A突变破坏了这一过程（图6G-6I）。这些数据表明AA可以直接结合Menin在Tyr323，这一过程对于NCM460细胞的恶性转化至关重要。

接下来，研究人员揭示AA-Menin相互作用如何影响H3K4三甲基化。首先，AA和Menin的对接区域位于中央腔，Menin和MLL蛋白的主要相互作用域位于此（图6C）。其次，靶向MLL1、MLL2或Menin的小干扰RNA显著破坏了AA引起的NCM460细胞活力的增加（详见原文补充材料）。Menin-MLL1/2相互作用在激活MLL1/2甲基转移酶活性中起着至关重要的作用。因此，研究人员推测AA可能作为闩锁加强Menin和MLL的相互作用并触发H3K4甲基化。事实上，外源补充AA明显促进了Menin和MLL1/2的相互作用，并随之增加了H3K4me3水平（图6J）。然后，cPLA2 KO降低了Menin和MLL1/2的结合，并且在补充AA后恢复了亲和力（图6K）。与此一致的是，外源性补充AA未能恢复Menin Y323A KI的NCM460细胞中Menin和MLL1/2的相互作用（图6L）。

体外共免疫沉淀实验一致显示，AA确实明显增强了重组Menin与截断的MLL1蛋白之间的相互作用（图6M）。后，计算结构分析表明，AA的参与增强了Menin和MLL1的相互作用，对接得分更低（图6N）。这些结果表明，AA可能通过Tyr323位点与Menin结合，介导Menin和MLL的相互作用。Menin-AA-MLL联合体可以形象地比喻为“榫卯结构”，其中AA充当闩锁，在维持Menin-MLL复合体的稳定性和完整性方面起着重要作用（图6O）。

图6 AA特异性结合到Menin蛋白并增强Menin-MLL1/2相互作用

7.Menin-MLL1相互作用抑制剂VTP50469和p110α选择性抑制剂阿培利司联合使用可抑制肿瘤

一种有效的选择性Menin-MLL1相互作用的抑制剂VTP50469已显示出显著的临床前疗效。然而，VTP50469的潜在抗实体肿瘤特性尚不清楚。为了解决这个问题，研究团队使用AOM/ DSS诱导的结直肠肿瘤发生模型实施了VTP50469指导的治疗策略（图7A）。虽然在PIK3CA WT细胞培养基组中治疗效果没有明显差异，但在VTP50469处理后，PIK3CA突变细胞培养基组的肿瘤数量明显减少，小鼠存活时间明显延长（图7B-7D）。一致的结果表明，VTP50469具有优先抑制携带PIK3CA突变的实体瘤的特性。接下来，研究人员采用患者来源的异种移植瘤（PDX）模型来评估VTP50469单独使用或与阿培利司联合使用的治疗效果（图7E）。在PIK3CA WT PDX模型中，联合用药仅导致肿瘤生长减速（图7F）。然而，在PIK3CA突变体PDX模型中，VTP50469和阿培利司的组合导致肿瘤消退（图7G）。总之，这些结果表明，VTP50469和阿培利司的联合可能是一种有效的治疗PIK3CA突变的癌症的方法。

图7 Menin-MLL1相互作用抑制剂VTP50469和p110α选择性抑制剂阿培利司联合使用可抑制肿瘤

研究总结

在本研究中，研究团队重新审视了肿瘤体细胞突变理论，并证明携带PIK3CA基因突变的肿瘤细胞向IECs传递致癌信号，启动其恶性转化，从而促进CRC的发生和进展。本研究证明了PIK3CA突变细胞将外泌体AA传递给IECs并触发染色质重塑，导致恶性转化。

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